MTT检测
MTT 是一种检测细胞存活和生长的方法。结论:用贴壁法成功建立了大鼠血管内皮细胞体外培养方法,冻存细胞存活率高,为体外研究提供了稳定的模型。其检测原理为活xi胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性 MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中,而死细胞无此功能。二jia基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒,用酶联免yi检测仪在 570nm 波长处测定其光吸收值,可间接反映活xi胞数量。
大鼠gu髓间充质gan细胞的分离
操作方法
(1 )取SD大鼠( 2周龄),颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉, PBS溶液冲洗两遍。
(3 )从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注she器吸取DMEM/F 12溶液冲出gu髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。
(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。
(5 ) 2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状), PBS洗三次。
(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的DMEM/F 12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中, 置37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。
( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,-般10d细胞生长融合。
(8 )经0.25%胰酶消化,1 : 2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。
BrdU染色原理
BrdU (5-脱氧尿核苷)是胸腺的衍生物,常用于标记中新合成的DNA,可代替胸腺选择性整合到细胞中新合成的DNA中(细胞周期S期)。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。这种掺入可以稳定存在,随着DNA进入子细胞中BrdU特异性可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。BrdU特异性可以用于检测BrdU的掺入,从而判断细胞的增殖能力。
zhu射或细胞培养后利用抗Brdu单,ICC染色,显示增殖细胞。细胞沉淀用15mlMEF生长培养基重悬后进行细胞计数(--般8只14天的胎鼠可获得2-3x107细胞)。同时结合其它细胞标记物,双重染色,可判断增殖细胞的种类,增殖速度,对研究细胞动力学有重要意义。因组织细胞内无内源性Brdu存在,所以Brdu应用较广掺入双链DNA内的Brdu,以氢链与腺呤结合,不能直接与抗Brdu反应,需经解链使Brdu暴露方能被染色。常用的解链方法为盐酸加热、蛋白酶处理等,使DNA双链部分单链化,抗Brdu小鼠单与增殖细胞核内的Brdu结合,再经酶标抗小鼠IgG孵育、
呈色,显示进入S期细胞的情况。