点击图片查看原图甲l基化特异性的PCR
Herman 等（ 1996 ）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。离心后吸上清液400u1移入相应编号的EP管中，再加入400ul异充分混匀。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。
特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。
亚硫酸氢盐测序法（Bisulfite sequencing PCR，BSP）
亚硫酸氢盐修饰后测序法（ BSP ） Frommer 等（ 1992 ）提出的研究 DNA jia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个 CpG 位点的jia基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了smallRNA的信息，所以需要另外再构建一个smallRNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他smallRNA的鉴定及注释信息。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。
特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。
线粒体测序
线粒体是真核生物的重要细胞器，是生物体的能量工厂，参与能量代谢、信号转导、细胞凋亡等许多生命活动，对生物的生理活动起着至关重要的作用。大部分线粒体基因由于其母系遗传特性以及进化速率较快等特点，被广泛地用于种群遗传学、进化生物学、谱系地理学和系统发育学、疾病诊断等学科领域。高通量的蛋白质组学研究技术可以在上述过程中筛选出具有潜在价值的生物标记和靶点。线粒体全基因组在生物进化的研究中具有的优势。由于线粒体有着与真核生物长期共生的进化历史，因此其基因组包含了反映物种进化的关键信息，同时，相对于核基因组，线粒体基因组小，容易对大量物种进行横向的比较分析，有利于生物进化的研究，因而受到进化生物学家的钟爱。线粒体的组成可以从两个层面上反映物种及群体的遗传和进化，即核酸序列组成和基因组的结构特征，两者的特征具有不同的进化机制和进化速度，在进化生物学研究中可以很好的互补。
EMSA实验
EMSA:凝胶迁移或电泳迁移率检测是一种检测蛋白质和DNA序列相结合的技术，初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。分为2种类型：同位素标记探针，非同位素标记探针。
通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚bing烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。所有样品4C离心，转速:13500转1分钟，时间:15min。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RN片duan和gua核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
13.合成的引物5'端是否有磷酸化
答：合成的引物5'为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5′端磷酸化，或者要求引物合成公司合成时直接在5′或3′端进行磷酸化，需要另外收费。
14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题？
连接反应需要引物的5’磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。高l效液相色谱法适用于能在特定填充剂的色谱柱上进行分离的药品的分析测定，特别是多组分药品的测定、杂质检查和大分子物质的测定。磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。SiRNA分子具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。
