自噬流检测
自噬是调节真核细鹏生长、和能量代谢的重要生物学机制。细胞自噬行使其生物学功能的前提是自噬流的话化。大量证据表明自噬流受损与多种慢性炎性疾病,特别是、神经退行性疾病及组织纤维化的发病密切相关,目前对于自噬液的检别是自噬与其相关疾病研究领域的热点。2、将细胞悬液作梯度倍数稀释,每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL37预温培养液的皿中,并轻轻转动,使细胞分散均匀。由于自噬流是一个曲多个步骤组成的动态过程。因此往需要精细的突验才能准确判断自啦流状态。
细胞ELISPOT检测
1.培养板的预处理:在24孔培养板内加0.5ml 0.2%戊er醛,37℃,4h,弃掉板中的处理液,用PBS洗涤3次,每次3min;
2.抗原包被:将适量抗原溶于包被缓冲液中,每孔加入0.5ml,4℃过夜,PBS-T洗涤3次,每次3min;
3.制备细胞悬液:将待测已致敏小鼠处死,取出pi脏,置于加有Hanks液的平皿内,用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后,赶出细胞,用毛细吸管轻轻吹散细胞团后,将悬液通过250目尼龙网,取滤液,1000r/min离心5min,Hanks液洗涤3次,计数细胞后,用1640液重新悬浮细胞,配成所需浓度;它能指示某一yao物或者物质(yi制剂)在抑制某些生物程序(或者是包含在此程序中的某些物质,比如酶,细胞受体或是微生物)的半量。
4.往各孔中加入0.5ml含不同浓度(104-106/ml)的细胞悬液,置37℃,5%CO2条件下孵育2-4h,弃掉培养液,PBS-T洗涤3次,每次3min;
5.往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti(Bio-Ab)(2μg/ml),37℃孵育1h或4℃过夜,弃掉液体,PBS-T洗涤3次,每次3min;
6.加入辣根过氧化物酶结合的亲合素(Avi-HRP)(2μg/ml),37℃孵育30min,弃掉液体,PBS-T洗涤3次,每次3min;
7.配制明胶-底物液:在37℃水浴中,将2.5mlTMB溶液(4mg/ml jia醇溶液)滴加入7.5ml10%明胶溶液(用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制)边加边搅,溶液呈白色,加入14μl 3% H202;
8.显色与计数:将培养板底冰浴,每孔加入0.6ml明胶-底物液,约3min,混合液凝固,将培养板取出,置室温5min,将板倒置,用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。
三、自噬过程进行观察和检测
1、观察自噬体的形成
由于自噬体属于亚细胞结构,普通光镜下看不到,因此,直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状,双层或多层膜,有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1 )的特征为:双层或多层膜的液泡状结构,内含胞浆成分,如线粒体、内质网、核糖体等。结果:约24小时组织块边缘有游离的新生细胞长出,7天即融合成片。自噬溶酶体(AV2 )的特征为:单层膜,胞浆成分己降解。( autophagic vacuolo AV )
2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋 白来示踪自噬形成由于电镜耗时长,不利于监测(Monitoring) 自噬形成,人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时,GFP-LC3融合蛋 白弥散在胞浆中;自噬形成时,GFP-LC3融合蛋白转 位至自噬体膜,在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点,一个斑点相当于一个自噬体,可以通过计数来评价自噬活性的高低。G三质粒系统,将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中,培养48h后,收集上清。
3、利用Western Blot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时,胞浆型LC3 (即 LC3-I)会酶解掉一小段多肽,转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID,因此,LC3-II/比值 的大小可估计自噬水平的高低。(注意: LC3对LC3-II有更高的亲和力,会造成假阳性。平板克l隆形成实验基本步骤::1、取对数生长期的各组细胞,分别用0。方法2和3需结合使用,同时需考虑溶酶体活性的影响。)
4、MDC (Monodansylcadaverine ,单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体,所有酸性液泡都被染色,故属于非特异性的。
5、CellTrackerTM Green染色:主要用于双染色,但其能染所有的液泡,故也属于非特异性的。
大鼠gu髓间充质gan细胞的分离
操作方法
(1 )取SD大鼠( 2周龄),颈椎脱臼法处死后立即用75%乙醇浸泡,移入超净工作台内,用大头针固定大鼠四肢于工作台面的泡沫板上。
(2)碘酒擦拭四肢,再用酒精棉球擦拭,无菌条件下用灭菌消毒后的镊子和剪刀分离出大鼠股骨和胫骨,剔除骨头表面肌肉, PBS溶液冲洗两遍。
(3 )从中间剪断股骨和胫骨,用2ml无菌注she器吸取DMEM/F 12溶液冲出gu髓细胞多次,再用针头吹打,吸管吸入离心管内,1000r/min离心5min,弃上清,用PBS重悬细胞。
(4 )缓慢将细胞悬液加入预先装有5mL淋巴细胞分离液的15mL离心管内,保持细胞悬液在淋巴细胞分离液上层,注意不要搅动液面,保持二者分层界面。
(5 ) 2000rpm离心15-25min,离心后溶液分4层,吸取中间骨sui基质细胞层(白色浑浊状), PBS洗三次。
(6)用含15%胎牛xue清及青链mei素的DMEM/F 12以106/mL的细胞浓度接种于25cm2培养瓶中, 置37°C、5%CO2恒温培养箱中培养。
( 7 ) 24小时后弃去培养液(看细胞贴壁情况),PBS冲洗2-3次去除末贴壁细胞,加入培养液继续培养。以后每3d半量换液1次,-般10d细胞生长融合。
(8 )经0.25%胰酶消化,1 : 2传代,其后一般3-5d传代1次,选取生长良好的第三代细胞进行后续实验。